病毒病给苹果生产带来巨大危害，目前尚无有效防治药剂，繁育无毒苗木是最为有效的解决病毒病途径。建立准确、灵敏、快速的苹果病毒检测体系，是繁育无毒苗木的重要环节，也是我国实现苹果无毒栽培的重要技术支撑。

根据危害特点可将苹果病毒分为非潜隐性病毒（Non-Latentvirus）和潜隐性病毒（Latentvirus）两大类。文献表明，我国主要苹果病毒有7种，分别为：苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）、苹果凹果类病毒（Apple dimple fruit viroid, ADFVd）、苹果花叶病毒（Apple mosaic virus，ApMV）、苹果坏死花叶病毒（Apple necrotic mosaic virus, ApNMV）、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）和苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV），其中后三种为潜隐性病毒，在常规品种上不表现明显症状，前四种为非潜隐性病毒，常规品种上一般有明显症状，但在一定环境条件下会出现隐症现象，因此，病毒的诊断须辅以分子检测。

一、7种主要苹果病毒的生物学特性

1. 苹果锈果类病毒

ASSVd属于马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae），是苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）的代表成员。存在于植物细胞核内，有中央保守序列，不具核酶活性，非对称滚环复制。ASSVd在苹果、梨、野生苹果、野生梨、桃、杏、樱桃和喜马拉雅野生樱桃上先后被报道。ASSVd在苹果树上的症状主要呈现在果实上，症状类型主要取决于栽培品种和环境条件的变化，主要表现为五种病状：锈果型、花脸型、锈果-花脸型、环斑型和绿点型。ASSVd在寄主的细胞核中复制积累，它可以在感病寄主的叶、茎、表皮、根茎以及果实的表皮、果肉和种子中检测到。Koganezawa比较了ASSVd在不同的组织中的含量，发现ASSVd在树皮组织中含量最高。ASSVd的主要传播途径有嫁接传播、修剪工具传播及种子传播。被这种类病毒侵染的果树将终生带毒，且目前尚无有效的防治药剂。

2. 苹果凹果类病毒

ADFVd属于马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae），是苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）的代表成员。基因组大小约306-307nt，具有苹果锈果类病毒属成员的典型中央保守区的准棒状结构，ADFVd与ASSVd序列相似性达 63.5%。ADFVd最初在意大利苹果上发现，造成畸形果并在红色果皮上伴有 3-4mm 直径的凹形绿色斑点，这些斑点通常造成果实萎缩并与下层果肉中的坏死部分相关，在一些苹果品种上的症状与ASSVd诱导的症状相似。

3. 苹果花叶病毒和苹果坏死花叶病毒

ApMV 在苹果上发生普遍，该病毒为等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）成员，病毒粒体为等轴对称二十面体的准等轴对称颗粒，直径为26-35 nm。ApMV为三分体基因组，每个病毒粒子包裹一条RNA核酸链（RNA1或RNA2或RNA3或RNA4），正义链RNA、线性，每个RNA片段的5′端为甲基化帽子结构，3′端既不是poly（A）, 也不是tRNA样结构，所有RNA的3′端折成稳定发卡结构，并含有AUGC盒。ApMV危害寄主表现为叶片不均匀褪绿，形成黄绿相间的花叶，根据病斑形状和大小分为5种类型：斑驳型、花叶型、条斑型、环斑型、镶边型。叶片花叶严重影响苹果植株的光合作用，病树提早落叶，造成减产，果实不耐贮藏。ApMV在世界各地广泛分布，西欧、东欧、美国、日本、中国等地均有报道。许多栽培品种对其表现敏感，如乔纳金、金冠等。国外的研究表明ApMV不仅可造成苹果的花叶，还能使感染品种的树体生长量减少50%，树干直径减少20%，苹果产量减少30%；有文献报道ApMV侵染金冠、蛇果、麦金托什苹果，分别造成46%、42%和9%的减产。ApMV目前未发现传播介体，主要通过受病毒侵染的砧木和接穗在嫁接过程中传播扩散，可能通过病株和健康株的自然根接传播，是否能通过种子和花粉传播尚不明确。

2016年Hiroki Noda1报道，引起苹果花叶症状的病原还包括ApNMV，在我国苹果产区主要由ApNMV引起苹果花叶症状。该病毒与ApMV同属。具体生物学特性还不明确。

4. 苹果茎痘病毒

ASPV为凹陷病毒属（Foreavirus）的代表种, 病毒粒体弯曲线状，螺旋对称结构, 轴腔不清晰, 螺旋结构模糊，直径为12-15 nm, 粒体长800 nm。基因组核酸为正单链RNA，线性，基因组由9306 个核苷酸组成，5'端有一段33nt非编码序列，最大的ORF1（34-6582nt）编码247 kDa的复制相关蛋白，ORF2（6685-7353 nt）、ORF3（7358-7 717 nt）、ORF4（7629 -7 838 nt）分别编码25、13和17 kDa蛋白，组成一个三基因盒，可能参与细胞间的运动，ORF5（7930-9 171nt）编码44 kDa的外壳蛋白, 仅接着是一段135个核苷酸的非编码序列，3′末端具有poly（A）尾巴。ASPV病树症状多不明显, 呈慢性危害。果树生长不良, 严重影响产量。在相应的指示植物上, 树皮内层及白色木质部产生褐色斑块。ASPV的寄主范围较广，木本寄主包括苹果、梨、樱桃和海棠等，此外可人工接种多种木本和草本植物。鉴别寄主为西方烟、斯派227、弗吉尼亚小苹果等。该病毒分布于美国、德国、意大利、日本、新西兰、非洲、瑞士、匈牙利、加拿大、澳大利亚、韩国以及中国等地。ASPV目前尚未发现昆虫传播介体，在木本寄主上均可通过嫁接传染，在果园中，病毒可能通过病、健树根系接触传播，通过工具的交叉使用进行传播，还可能通过汁液相互沾染进行传播，不能通过种传和花粉传播。

5. 苹果茎沟病毒

ASGV属于发形病毒属（Capillovirus）, 病毒粒体为极弯曲线状，有明显的纵横交叉带，轴腔不清晰，螺旋结构很清楚，直径为12 nm左右，粒体长600-700 nm。基因组核酸为正单链RNA，线性，基因组6500 nt，上游是一个142 nt的非编码区，含2个重叠的ORF、ORF1（37- 6341nt）编码241 kDa的多聚蛋白, 随后切割成甲基转移酶（Mt）、类木瓜蛋白酶（Ppro）、解旋酶（Hel）、聚合酶（Pol），外壳蛋白在C端，ORF2在ORF1内，始于4788 nt，编码36 kDa的移动蛋白（MP），3′末端具有poly（A）尾巴。该病毒侵染症状为顶端生长消弱，嫁接部位树皮下的木质部有凹沟，大部分吸收根死亡，树势严重衰退。在相应的指示植物上木质部产生条沟。该病毒是苹果和梨上发生普遍的潜隐性病毒之一，危害苹果、梨、柑橘、樱桃、杏等果树和百合，其寄主有20种植物，主要包括双子叶植物中的番杏科、苋科、藜科、葫芦科、唇形科、豆科、蔷薇科、玄参科、茄科等。鉴别寄主为弗吉尼亚小苹果、昆诺藜、心叶烟及菜豆。该病毒在法国、意大利、美国、加拿大、中国、日本、韩国、南非、澳大利亚等国家均有分布。ASGV在昆诺藜上可通过种子传播，在木本寄主上可通过嫁接传播，苹果上可机械传播，亦可通过汁液，摩擦接种感染草本寄主，无已知介体。

6. 苹果褪绿叶斑病毒

ACLSV为纤毛病毒属（Trichovirus）的代表成员，病毒粒体为弯曲线状, 螺旋对称结构，直径12nm，长约720- 740 nm。基因组核酸为正单链RNA，线性，大小7555 nt，基因组含有3个互相重叠的开放阅读框，分别编码216.5、50.4和21.4 kDa蛋白, 最大的ORF编码产物可能参与病毒复制，最小的蛋白为外壳蛋白。基因组5′端有帽子结构，3′端有poly（A）尾。ACLSV可侵染李、桃、樱桃、杏等核果类果树，此外还能侵染昆诺藜、苋色藜、灰藜、西方烟、白肋烟、菜豆、黄瓜、笋瓜、莙荙菜、千日红、苋菜和菠菜等8个科15种草本植物，寄主范围广泛，在世界各国都有发生。其鉴别寄主为苏俄苹果（R12740~7A）、大果海棠、昆诺藜及苋色藜。英国、法国、德国、波兰、匈牙利、阿尔巴尼亚、黎巴嫩、约旦、土耳其、西班牙、智利、希腊、南斯拉夫、中国、日本、美国等国家均有报道。我国于1989年初次报道了苹果树上的ACLSV。ACLSV主要通过嫁接传播，机械接种可能传播，非种传，线虫能否传播至今未能确定。

二、七种主要苹果病毒的RT-PCR检测方案

建议春末、秋初采集果树根部或一年生、两年生枝皮进行七种主要苹果病毒的RT-PCR检测。样本采集后尽快进行RNA提取和检测，否则影响检测结果的准确性。样本采集后，在4-25℃之间，以枝条形式报纸包裹保存，建议不要超过3天，-80℃可长期保存。

1. RNA提取

使用组织破碎研磨仪将样品研磨至粉末之后，参照天根的RNA prep pure Plant Kit（货号DP432）说明书提取植物Total RNA。

2. cDNA合成

两步法cDNA合成方法如下：

1）冰上进行下列操作。

模板RNA                 3.0 μL

 随机引物（20 pmol /μL）   1.0 μL

 DEPC水                  2.0 μL

总体积                    6.0 μL      

2）70℃保温10 min，冰上冷却2 min。

3）离心数秒。

4）上述Microtube管中配置下列反转录体系。

上述                      6.0 μL

 5 M-MLV Buffer           2.0 μL

dNTPs（2.5 mM each）      0.5 μL

 RNA酶抑制剂（40 U/μL） 0.25 μL

M-MLV（200 U/μL）      0.5 μL

 DEPC水                  0.75 μL
      总体积                   10.0 μL

5）42℃保温1 h。

6）70℃灭活15 min，冰上冷却。

7）离心数秒，-20℃保存备用。

3. PCR

以上述合成的cDNA为模板，按以下体系和程序扩增目的片段。

（1）病毒特异性引物

（2）PCR 反应体系：

Primer-R、Primer-F分别对应指病毒特异性引物的3’和5’端。

（3）反应程序：

4. 琼脂糖凝胶电泳

检测时设阴、阳对照，1.5%琼脂糖电泳，上样量5-8 µL，110V稳压电泳45 min，0.5 μg/mL EB溶液染色10 min，凝胶成像系统照相记录。观察到与阳性对照相同的目的条带的样品为阳性，带病毒；与阴性对照一样，未观察到目的条带的样品为阴性，无病毒。